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光学显微镜的创新

作者:硬度计服务商欧宝体育最新官方入口
发布时间:2021-10-15

在所有科学仪器中,可能没有比光学显微镜更多地投入到其改进中的思想和劳动了。过去几个世纪以来,它的演变是由希望观察和测量比以往任何时候都更小、更暗(图 1)和更深的组织内部现象的科学家推动的

图 1 - 牛肺动脉上皮细胞

当今改进的显微镜产生的图像示例如图 1 所示,它说明了使用 CFI60 40X 萤石物镜和尼康 DXM1200 数码相机Eclipse E600显微镜上拍摄的组织培养细胞的数字捕获多色荧光图像

一个世纪前,显微镜达到了经典光本质理论预测的分辨率极限。然而,要让显微镜实时检查活细胞的内部运作,需要的不仅仅是分辨率。以前由技术大师在极少数实验室完成的技术现在简化为简单的常规临床程序。显微镜设计师仔细聆听显微镜专家的意见,带来了巨大的创新。本文总结了显微镜设计的最新进展,并重点介绍了最近开发的光学系统如何促进科学进步。

有限与无限光学系统

在生物显微镜相对简单的时代,在落射荧光和共聚焦技术出现之前,几乎不需要在物镜和目镜之间插入厚厚的光学元件 - 透镜间空间。标准的 160 或 170 毫米管长度,物镜安装法兰和目镜座之间的距离,很好地适用于此。这些仪器在透镜间空间具有会聚光。冶金学家和地质学家需要偏振光,而在超薄偏振器发明之前,这需要在该空间中插入大量棱镜和其他配件。1930 年代的一家制造商,由于标准管中的空间不足,并且由于棱镜而受到像差校正问题的困扰,因此首先尝试使用无限远光学版本来解决这些问题。

术语“无限远”意味着物镜被设计为将其图像投影到无限远,而不是某个有限距离。无限远光学系统在物镜和目镜之间提供平行光区域。使用这些系统,可以将复杂的光学组件插入平行光空间中,而不会引入光学像差或减少物镜的自由工作距离。该系统还保留了物镜组的齐焦性(图 2)。在呈现图2是CFI60光路的概念图。无限远光学系统由一个物镜、一个用于会聚光束的管透镜和一个目镜组成。模块和组件可以放置在物镜和镜筒透镜之间的平行光路中,以创建一个完全灵活的系统,无需额外的中继光学器件。像点的位置在轴向和横向都保持不变,物镜和管镜之间的对齐也是如此。

图 2 - CFI60 光路

当然,为了形成我们可以看到或记录的图像,来自无限远型物镜的光必须通过平行光空间和目镜之间的管透镜或第二个物镜再次会聚。通常两个,在一种情况下多达三个,主要光学组件可以放置在这个空间中,而不会降低性能。

现在可以设计附件和插入的组件以实现精确 1 倍的放大倍率,这在将多种光学技术与同一样品进行比较时非常有价值。例如,当安装用于落射荧光和微分干涉对比 (DIC) 的光学器件时,仍有空间容纳第三个设备 - 放大倍数转换器、示教头、用于两台摄像机的多端口组件或用于与数字化垫跟踪神经元。

在多年前的经典显微镜中,镜头设计者在校正镜头像差、球面和色差(轴向和横向)像差、彗差、散光和场曲时,可以同时考虑物镜和目镜。横向色差 (LCA) 也称为倍率色差 - 在同一焦平面上形成红色、绿色和蓝色图像,但每种颜色形成不同大小的图像。

传统上,LCA 非常难以校正,并且经常在物镜中未校正,而在目镜中进行补偿。多年前可用的各种光学玻璃和计算技术不足以完成物镜内 LCA 校正的任务。在未校正的透镜间光束中插入厚组件将进一步扰乱光学校正。

即使在今天,并非所有制造商都在目标范围内实现了 LCA 的完全校正。Nikon Inc.(纽约州梅尔维尔)开发的新型玻璃配方具有极低的色散;因此,所有像差都在物镜本身内得到纠正。该公司于 1976 年推出了第一款完全校正的 CF(无色差)物镜,这项新技术在 CFI60(无铬无限远,60 毫米齐焦肩高)物镜、套管透镜和目镜(尼康)中不断发展。在设计有无限管长度的各种显微镜系统中,只有这个系统结合了充分利用这一概念所需的其他设计更改。

新镜头

为无限远显微镜系统设计理想的物镜需要比通常数量更多的透镜元件,因为出射光束必须聚焦在无限远。除此之外,还需要荧光技术,例如 M-FISH(多色荧光原位杂交)(图 3),它基于收集尽可能多的光子,并且需要更高数值孔径 (NA) 的透镜。除此之外,共聚焦技术对穿透厚组织的高数值孔径、长工作距离透镜的要求也是如此。为了满足这些需求,今天的镜头必须具有更大物理直径的玻璃元件。综上所述,这些要求使旧的镜片尺寸标准过时了。图 3 中的示例是成纤维细胞的多色荧光图像,使用Eclipse E800显微镜使用 CFI60 60X、NA 1.4 油浸物镜在胶片上捕获

图 3 - 荧光原位杂交

英国皇家显微学会在 1800 年代中期制定的标准设定了物镜安装螺纹的直径。这个尺寸虽然在当时很慷慨并且适合旧的黄铜显微镜,但成为对光学设计的严重限制。此外,以前关于齐焦肩高的行业标准——从样品到物镜安装法兰的距离——被证明不适合当前设计的复杂性。这些尺寸的新标准(25 毫米螺纹直径和 60 毫米齐焦肩高,尼康)使创新的新镜头成为可能,并确保有足够的改进空间。Tube Lens 的焦距为 200 mm,可实现超长工作距离和高 NA 的镜头。

所述CFI60透镜具有更高的NA比通常可用于标准放大倍率,提供增加的细节的分辨率,更高的聚光功率,并在共聚焦应用的高性能。Eclipse 仪器的许多物镜都有一个共同的特性,即工作距离比平常长。这允许从上到下聚焦厚样品,而不必担心会破坏盖玻片或损坏物镜本身。涂抹浸油更容易,更换样品也更容易。可以使用厚底腔室,并且可以使用更高倍率的镜头进行显微操作。

在现在揭示细胞内部机制和动态活动的研究中,荧光发射的每个光子都是宝贵的。以最高效率收集这些需要尽可能高数值孔径的物镜。Plan Fluor 40X NA 1.30 油浸透镜结合了放大倍率、高 NA、场平坦度、长工作距离和高紫外线透射率,针对荧光研究的高效工作进行了优化。对于等倍放大率的镜头,落射照明系统中的图像亮度与数值孔径的四次方成正比。计算表明,将0.65 NA的普通高干镜片与1.30 NA的40X浸没镜片相比,亮度提高了16倍。

更好的高干图像

许多观察都是用普通的非浸入式 40X 物镜进行的,即所谓的高干镜头。在这种放大倍数下,物镜需要相当高的 NA 才能提供 40 倍放大率应显示的丰富细节。通常为 40X 镜头提供的最低 NA 为 0.65。即使在这个数值孔径下,显微镜的光学性能也取决于镜头设计者和制造商无法控制的一个光学组件 - 样品顶部的盖玻片。显微镜制造商建议使用 0.17 mm 的盖玻片厚度,并将其刻在物镜主体上(这对应于实验室供应商的 #1 1/2 盖玻片)。

许多标本是用其他厚度的盖玻片制备的。这对于低倍率下的观察影响不大,但在 40X 及更高倍率下却有很大影响。用镜头设计者的话说,非标准盖玻片会扰乱物镜的球面像差;用用户的话来说,图像失去对比度,看起来多云。

虽然 0.65 是普通 40X 镜头的数值孔径,但性能更高的干物镜可以高达 0.95。这些受到盖玻片厚度的不利影响,因此必须在物镜上安装校正环。通过在观察图像外观的同时转动它来优化图像质量。转动轴环会改变物镜某些组件的内部间距,不幸的是,这也会改变镜头的有效焦距。在实践中,人们必须同时用一只手转动项圈和另一只手转动微调旋钮,同时寻找最清晰的图像。许多用户从未掌握这项技术。高数值孔径、高干镜头(尼康)的专利设计极大地减少了焦点偏移,从而更容易优化图像质量。对于高于 0.95 的 NA,提供浸入式镜头。

通用目标

每个制造商都列出了不同的观察技术的特殊物镜,而不是普通的明场技术——例如相差、DIC 和荧光技术。使用多种技术的研究人员曾经需要为任何给定的放大倍率购买几个这样的物镜。到目前为止,不可能为这四个目的设计一个目标而不显着降低性能。Plan Fluor DLL 镜头(尼康)可以在所有四种模式下运行,而不会牺牲图像质量。它们节省了金钱、便利性和鼻梁架上的空间

最低功耗目标

在生活中,我们通常首先观察一个场景,然后放大吸引我们眼球的细节。在显微镜下,我们首先从低倍率开始,然后转向更高倍率。病理学家、神经学家和植物学家是众多生命科学专业人士中的一员,他们经常依靠低功率进行定位并从字面上“了解全局”。然而,在许多显微镜上,使用 10X 物镜和 10X 目镜的最低倍率为 100X,与自然尺寸相比有很大的飞跃。由于显微镜师通常不愿意更换为低倍目镜,因此低倍物镜是低倍率的最佳选择。

使用 CFI60 0.5X 物镜,用户可以在广阔的视野内观察和拍照。该物镜的实际视野为 50 毫米,可用于大型标本的宏观观察,例如图 4所示的椴茎薄片与传统的无限远光学系统相比,物镜提供的图像区域大小是其五倍以上。可以在 35 毫米胶片上进行实际尺寸的摄影。

主要制造商提供了大约的目标。4X、2X 甚至 1X 功率。CFI Macroplan 0.5X 物镜及其特殊配件在目镜处呈现 5X 图像,并将在 35 毫米胶片上拍摄自然尺寸的 1X 图像(见图 4)。该镜头提供了极高水平的细节和色度校正,使显微镜能够提供尽可能宽的放大范围。

人体工学设计

显微镜不仅仅是光学器件。它是科学家与身体接触最多的实验室仪器。在购买一件可能会坐几个小时的乐器时,考虑身体舒适度至关重要。这是在规格表中无法轻易表达的东西。必须亲身体验。

在许多较旧的显微镜中(甚至在一些较新的显微镜中),各种控件都放置在制造商最方便的位置。这有时会导致尴尬或不便。

所有主要制造商都在其支架的设计中考虑了人体工程学因素,但 Eclipse 仪器将人体工程学因素提升到了更高的水平。在设计中考虑了对用户如何坐在他们的仪器上的广泛研究,方便到达距离的测量,以及舒适的手臂和头部位置的确定。E800 显微镜上载物台手柄和聚焦控制旋钮的位置与图 5 (a) 中的传统显微镜进行了比较通过保持自然姿势并使双手与身体等距,可以减轻压力。此外,载物台手柄和微调焦旋钮的位置可以用一只手操作,提高了观察的舒适度。尼康的许多显微镜都提供直立和倾斜的目镜筒(图 5 (b)),以确保通过在自然位置使用系统来提高检查效率并提高操作员的舒适度。

此外,向镜头间空间添加组件并不总是很容易完成。如果组件只是像大多数制造商那样堆叠在一起,双目观察头和目镜在它们上面,结果通常是令人不舒服的高观察布置,用户伸长脖子通过目镜观察。在 Eclipse 中,最多可以将三个组件插入到透镜间隙中,而无需改变仪器恒定、方便的眼睛位置。

在新的支架中,最常用的控件被放置在显微镜师最方便的地方,而不管制造是否容易。相互结合使用的控件(例如舞台移动和精细对焦)已放置在可以用同一只手的手指进行调整的位置。前臂舒适地放在桌面上,最常用的控件自然地落在指尖之下。载物台的低得多的位置使幻灯片更换方便。舞台控制装置可以安装在任一侧,以便左手或右手操作。

新设计的支架的其他特性包括大大增强的时间和热稳定性,这对于随时间推移的研究非常重要,例如有丝分裂研究和胚胎学。还增加了振动阻尼以提高捕获图像的分辨率。


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